O que é HPLC

Conforme concebido inicialmente por Tswett no início do século passado, a cromatografia era praticada de forma muito simples, colocando um material sólido (fse estacionária) dentro de um tubo de vidro aberto nas duas extremidades (Coluna) e aplicando a amostra em uma delas. Nesta época Tswett estudava a separação de pigmentos presentes em extratos de plantas. A seguir, passava através da amostra um líquido (fase móvel) e os corantes se separavam formando manchas coloridas. As manchas eram isoladas umas das outras e analisadas posteriormente. Este procedimento era tedioso, pouco quantitativo e demorado. Ao longo da evolução da cromatografia líquida, várias inovações foram sendo adicionadas, sendo uma delas a passagem contínua de fase móvel dentro da coluna. Esta técnica é denominada eluição, e a fase móvel é chamada de eluente. Outra inovação importante ocorreu na década de 1960 com a diminuição significativa do tamanho das partículas empregadas como fase estacionária (geralmente baseadas em sílica ou óxido de silício), aumentando a eficiência das colunas. Empregando partículas menores a resistência à passagem da fase móvel ficou crítica e a técnica muito lenta. A alternativa foi empregar-se uma bomba para pressurizar e empurrar a fase móvel através da coluna, ao invés do uso apenas da pressão gravitacional. Como neste caso a coluna precisava ser fechada nas duas extremidades, isto facilitou o emprego de uma válvula para introdução de pequenas quantidades de amostra em uma extremidade (chamada válvula de injeção) e de um espectrofotômetro com uma cela em fluxo do outro (denominada detector). Assim, pequenas quantidades de amostras (tipicamente 20 – 50 µL) eram introduzidas na coluna contendo partículas pequenas (tipicamente menores que 10 µm) e os compostos eluídos pela fase móvel eram detectados em um fotômetro ou espectrofotômetro e um cromatograma era desenhado em um papel de um registrador potenciométrico. Para diferenciar esta técnica da cromatografia “clássica” foi cunhado o termo HPLC (“High Pressure Liquid Chromatography”, ou seja, Cromatografia Líquida de Alta Pressão). Uma vez que rapidamente verificou-se que a pressão não era um componente importante na separação mas sim uma necessidade para empurrar-se a fase móvel através das partículas pequenas (e que continuava a diminuir em tamanho e aumentar a pressão necessária para passar a fase móvel através delas), decidiu-se manter a sigla HPLC porém mudar o sgnificado para “High Performance Liquid Chromatography”. Outra expressão proposta por Horvath para descrever esta técnica e diferenciá-la da cromatografia líquida “clássica” foi Cromatografia Líquida Moderna (“Modern Liquid Chromatography”).

 

Referências Bibliográficas:

1. Lanças, F.M. “Cromatografia Líquida Moderna”, Editora Átomo, 2009.